熒光和熒光壽命
分子包含多個單（dān）能態S0、S1、S2…和三重態T1…，每個（gè）能態都包含多（duō）個精細的能級。正常（cháng）情況（kuàng）下，大部分電子處在*低能態即基（jī）態S0 的*低（dī）能級上，當（dāng）分子被光束照射，會吸收光子能量，電子（zǐ）被激發到更高的能態S1 或S2 上（shàng），在S2 能態上的電子隻能存在很短暫的時（shí）間，便會通過內轉換過程躍遷到（dào）S1 上，而S1 能態上的電子亦會在極短時間內躍遷到S1 的*低能級（jí）上，而這些電子會存在一段時間後通過（guò）震蕩弛豫輻射躍遷到（dào）基態，這個過程會釋放一個光子，即熒光。
此外（wài），亦會（huì）有電子（zǐ）躍遷至三重態T1 上，再由T1 躍遷至（zhì）基態，我們稱之（zhī）為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時，主（zhǔ）要在以下幾方麵進行分析：激發光譜，發（fā）射光譜、熒光強度、偏振熒光、熒光發光量子產率、熒光壽命等。其中熒光（guāng）壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發態上存在的平均（jun1）時間（納秒量級）。
熒光壽（shòu）命測試（shì）
熒（yíng）光（guāng）壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時域測量和頻（pín）域（yù）測量時間穩定性實驗測試曲線（xiàn）：
1 時域測量
由一束窄脈衝將熒光分子激發至較高能態S1，接著測量熒光的發射幾（jǐ）率隨時間（jiān）的變化。其中目（mù）前（qián）廣泛應用的是時間相關單光子計數，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時間相關（guān）單光子計數(TCSPC) 實現了從（cóng）百（bǎi）ps-ns-us 的瞬（shùn）態測試，此方法對（duì）數據的獲取完全依賴快速（sù）探測器（qì）和高速電（diàn）路。用統計（jì）的方法（fǎ）計算樣品受激後發出的*一個( 也是唯一的（de）一個) 光子與激發光之（zhī）間的時間差，也（yě）就是下圖的START( 激發時刻) 與STOP( 發光時刻) 的時間差。由於對於Stop 信號的要求，所以TCSPC 一般（bān）需要高重複頻率的光源作為激發（fā）源，其重複至少（shǎo）要在100KHz 以上，多數的光源都會達到MHz 量級；同時，在一般情況下還要對（duì）Stop 信號做數量上的控製，做到盡量滿足（zú）在一個激發周期內，樣品產生且隻產生一個光子的有效熒光信號，避免光子對的出現。
2 頻域測量
對連（lián）續激發光進行振幅調製後，分子（zǐ）發出的熒光強度也會受到振（zhèn）幅調製，兩個調製信號（hào）之間存在與熒光壽命相關的相位差，因此可以測量該相位差計算熒光壽命。
左圖為正弦調製激發光（綠色）頻域顯示，發射光信號（紅色）相應（yīng）的相位變（biàn）化（huà）頻域顯示。
右圖為對應不同壽命的調製和（hé）相位的頻域顯（xiǎn）示。TM- 調製壽命，TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術（FLIM）
顯微（wēi）熒（yíng）光壽命成像技術（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一種在顯微尺度下展現熒（yíng）光壽命空（kōng）間分布的技術，由於其不受樣品濃度影響（xiǎng），具有其他熒光成像技術無法（fǎ）代替的優異性能，目前在生物醫學（xué）工程（chéng）、光電半導體（tǐ）材料等領域是一種重要的表征測量（liàng）手段。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激（jī）光掃描FLIM。
寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術是用平（píng）行光照（zhào）明並由（yóu）物鏡（jìng）聚焦樣（yàng）品獲得熒光信號，再由一寬場（chǎng）相機采集熒光成像。寬場（chǎng）FLIM 常用於快速獲取大（dà）麵積樣品成像。時域或是頻域壽命采集都可（kě）以應用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高（gāo）幀率和（hé）低損傷的優勢。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對（duì）選定區域（yù）內的樣品逐（zhú）點獲取其熒光衰減曲線，再（zài）經過擬（nǐ）合*終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM，其在空間分辨率、信噪比方麵有更大的優勢。掃描方式有兩種：一種是固定（dìng）樣品，移動激光進行掃描，一種是固定激光（guāng），電動位移（yí）台帶動樣品移動進行掃描。
FLIM 應用（yòng）
材料科學領域（yù）生命科學領域
OmniFluo-FLIM係列顯微熒光壽命成（chéng）像係統應用案例
1 用熒光分子對海拉（lā）細（xì）胞進行染色
用（yòng）熒光分子轉（zhuǎn）子Bodipy-C12 對海拉細胞（宮頸癌細胞的一種） 進行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命（mìng）範圍1ns（藍色）到2.5ns（紅色）；
(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在（zài）1.6ns 附近，細胞中（zhōng）其他位置壽命較長，在1.8ns 附近。
用熒光分子轉子的時間分辨測量*大的好（hǎo）處在於熒光壽命具備足夠清晰的標簽特性，且與熒光團的濃度無關。[2]
2 金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽（shòu）命是熒光團到金表麵距離的函數；
(b) 用綠色（sè）熒（yíng）光蛋白（GFP）標記乳腺腺癌細胞的細胞膜的（de）共聚焦xz 橫截麵，垂直比例（lì）尺（chǐ）：5 m；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表麵附近的（de）GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽能電池
下圖研究中，展示了一種動態熱風（DHA）製（zhì）備工藝（yì）來控製全無機PSC 的薄膜形態和穩定性，該工藝不含有常規（guī）的有害反溶劑，可以在大氣環境中製備。同時，鈣鈦礦摻有（yǒu）鋇（Ba2+） 堿金（jīn）屬（shǔ）離子（BaI2:CsPbI2Br）。這種DHA 方法有助於形成均勻的晶粒並控製結晶，從而形成穩（wěn）定的全無機PSC。從而在環境條件下形成完整的（de）黑色相。經過DHA處理（lǐ）的鈣鈦礦光伏器件，在0.09cm小麵積下，效率為14.85%，在1x1cm的大麵積下，具有13.78%的*高效率（lǜ）。DHA方法製備的器件在300h後仍然保持初始效率的（de）92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在（zài）(a) 藍寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共（gòng）焦（jiāo）PL mapping 圖像。具（jù）有較小尺寸（cùn）的發光團的*高密度是觀察到在GaN 上（shàng）生（shēng）長的MQWs。在(c) 藍寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對於在GaN 上生長的MQWs，強的PL 強度（dù）區域與（yǔ）較長PL 衰減時間的區域很好地（dì）匹配。在(e) 藍寶石和(f)GaN 上生長的MQWs 在A 點和B 點測量的局部PL 衰減曲線，均標記在圖中。對於在GaN 上生長的MQWs，點（diǎn）A 和B 之間的PL 衰減時間差更高。
OmniFluo-FLIM係列顯微熒光壽命成像係統（tǒng）參數配置
北京www.91光（guāng）儀器有（yǒu）限公司提供的（de）顯（xiǎn）微（wēi）熒光（guāng）壽命成像係統（tǒng）是基於顯微和時間相關單光子計（jì）數（shù）技術，配合高精度位移台得到微觀樣品表麵各空間分布點的（de）熒光衰減曲線，再經過用數據擬合，得到（dào）樣品表麵發光壽命表征的影像。是光電半導體（tǐ）材料、熒光標記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒（miǎo）、幾十、幾百納秒尺度的物（wù）質的不二選擇。
參數指標：
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係統性能指標 |
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光譜掃描範圍 |
200-900nm |
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*小時（shí）間分辨率 |
16ps |
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熒光（guāng）壽命測量範圍 |
500ps-1μs@ 皮（pí）秒（miǎo）脈衝激光器 |
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空間分辨率 |
≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈衝激光器（qì） |
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熒光壽命檢（jiǎn）測IRF |
≤2ns |
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配置參數 |
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激發源及匹配光譜範圍 （光源參數（shù）基於（yú） 50MHz 重複頻率） |
375nm 皮秒脈衝激光（guāng）器，脈寬：30ps，平均功率1.5mW，熒（yíng）光波（bō）段：400-850nm |
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405nm 皮（pí）秒脈衝激光器，脈寬：25ps，平均功率2.5mW，熒光波段（duàn）：430-920nm |
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450nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：50ps，平均功率1.9mW，熒光波段：485-950nm |
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488nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：70ps，平均功率1.3mW，熒光波段：500-950nm |
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510nm 皮秒脈衝激（jī）光器，脈（mò）寬：75ps，平均功率1.1mW，熒（yíng）光波段：535-950nm |
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635nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：65ps，平（píng）均功率4.3mW，熒光波段：670-950nm |
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660nm 皮（pí）秒脈衝激光器，脈寬：60ps，平均功率1.9mW，熒光波段：690-950nm |
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670nm 皮秒脈衝激光器（qì），脈寬：40ps，平均功率0.8mW，熒光波段：700-950nm |
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科研級正置顯微鏡 |
落射明暗場鹵素燈照明，12V，100W 5 孔物鏡轉盤，標配明場用物鏡：10×，50×，100× 監視CCD：高清彩色CMOS 攝像（xiàng）頭，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有效（xiào）像素：1280H*1024V，掃描方式：逐行，快門方（fāng）式：電子快門 |
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電動位移台（tái） |
高精度電動XY 樣品台，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， *小步進：50nm，重複定位精度：＜ 1μm |
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光譜儀 |
320mm 焦距影（yǐng）像校正單色儀，雙入口、狹縫出口、CCD 出口， 配置三塊68×68mm 大麵積光（guāng）柵，波長準確度：±0.1nm， 波長重（chóng）複性：±0.01nm，掃描步距：0.0025nm，焦麵尺寸：30mm(w)×14mm(h)， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續電動可調 |
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探測器：製冷型紫外可見光電倍增管，光譜範圍：185-900nm（標（biāo）配，可擴展） |
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光譜CCD （可擴展PLmapping） |
低噪音科學級光譜CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測麵：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片， 低（dī）暗電流，*低製冷溫度-60℃ @25℃環境溫度，風冷（lěng），*高量子效率值>95% |
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時間（jiān）相關單光子計（jì）數器（TCSPC） |
時間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時間＜ 10ns， *高65535 個直方圖時間窗口，瞬時飽和計數率：100Mcps，支持穩態光譜測試； |
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OmniFluo-FM 熒光壽（shòu）命成像專用軟件 |
控製（zhì）功能：控製樣品平移台（tái）移動，通過顯微（wēi）鏡的明（míng）場光學像（xiàng）定（dìng）位到合適區域， 框選（xuǎn）掃描區（qū）域進（jìn）行掃描，逐點獲得熒光衰減曲線，實時生成熒光圖像等 數據處理功能（néng）：自動（dòng）對掃描獲得的FLIM 數據，逐點進行多（duō）組分熒光壽命（mìng）擬（nǐ）合 （組分數小於等於4），對逐點擬合獲得的熒光強度、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像（xiàng）顯示 圖像處理功能：直方圖（tú）、色表、等高線、截線分析、3D 顯示（shì）等（děng） |
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操作電腦（nǎo） |
品牌操作電腦（nǎo），Windows 10 操（cāo）作係（xì）統 |
FLIM 軟（ruǎn）件界麵
測試軟件的界麵遵循“All In One”的簡潔設計思路，用戶可在下圖所示的控製界麵中完成采集（jí）數據的所有步驟：包括控製樣品平（píng）移（yí）台（tái）移動（dòng），通過顯微鏡的明場光學像定位到（dào）合適區域，框（kuàng）選掃描區域進行（háng）掃（sǎo）描，逐點獲得熒光衰減曲線，實時生成（chéng）熒光（guāng）圖像等。
數據處理界麵
功能豐富的熒（yíng）光壽命數據處理軟件，充分挖掘（jué）用戶數據中的寶貴信息。可自動（dòng）對掃（sǎo）描獲得（dé）的FLIM 數據，逐點進行多（duō）組分熒（yíng）光壽命擬合（組分數小於等於4），對逐點擬合獲得（dé）的熒光強度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示。
自主開發的一套時間相關單（dān）光子計數（TCSPC）熒光（guāng）壽命的擬合算法，可對熒光衰減曲線中*多包含4 個時（shí）間組分的熒光過程進行（háng）擬合，獲得每個組分的熒光壽（shòu）命，光子數比例，計算評價函數和殘差。TCSPC 熒光壽命通常並非簡單的指數衰減過程，而是與光源（yuán）及探測器（qì）相關的儀器響應函數（IRF）與熒光衰減過程相互卷積（jī）的結果（guǒ），因此適當的擬合方法和參數選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要。該軟件可導入實際測量的（de）IRF 對衰（shuāi）減曲線（xiàn）進行卷積（jī）計算和擬合。但是大多數情況下， IRF 很（hěn）難正確的從實驗獲得，針（zhēn）對這種情況，軟件提供了兩種無需實驗獲取IRF 的擬合方法：
NO.1 通（tōng）過算法對數據上升沿進行擬合，獲得時間（jiān）響應函數IRF，然後對整條衰減（jiǎn）曲線進行卷積計算和擬合得到熒光壽命。
NO.2對於衰減時間遠長於儀器響應時間的，可對衰減曲線下降沿（yán）進行直接的指數擬合。該軟件經過大量測（cè）試，可以很好的滿（mǎn）足各種場合的用戶（hù）需求（qiú）。
MicroLED 微盤的熒光強度像（3D 顯（xiǎn）示）：
13810146393
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