熒光和熒光壽命
分子包含多（duō）個單能態S0、S1、S2…和三重態T1…，每個能態（tài）都包含多個精細（xì）的能級。正常情況下，大部分電子處在*低能態即基態S0 的*低能級上，當分子被（bèi）光束照射，會吸收光子能量，電子被激發到更高的能（néng）態S1 或S2 上，在（zài）S2 能態（tài）上的電子隻能存在很短暫的時間，便會通（tōng）過內轉換（huàn）過程躍遷到S1 上，而S1 能態上的電子亦（yì）會在極短時（shí）間內躍遷（qiān）到S1 的*低能級上，而這些電子會存在一段時間（jiān）後通過震蕩弛豫輻射（shè）躍遷到基態，這個過程（chéng）會釋放一個光子，即熒光。
此外，亦會有電子躍遷至三重態T1 上，再（zài）由T1 躍遷至基態，我們稱之為磷光。
熒光特性
研究熒光特性時，主要在以下幾方麵進行分析：激發光譜，發射光譜、熒光強度（dù）、偏振熒光、熒光發光量子（zǐ）產（chǎn）率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發態上存（cún）在的平均時間（納秒量級）。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納（nà）秒（miǎo）至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時（shí）域測量（liàng）和（hé）頻域測（cè）量時（shí）間穩（wěn）定性實驗（yàn）測試曲線：
1 時域測量
由一束窄脈衝將熒光分子激發至較高能態S1，接著測量熒光的發（fā）射幾率隨時間的變化。其中目前廣泛應用的是時間相關單光子計數（shù），即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)
時（shí）間（jiān）相關（guān）單光子（zǐ）計數(TCSPC) 實現了從百ps-ns-us 的瞬態測試，此方法對數據的獲取完全依賴快速探測器和高速電（diàn）路（lù）。用統計（jì）的方法計（jì）算樣品受激後發出的*一個( 也是唯一的一個) 光子與激發光之（zhī）間的時間差，也就（jiù）是下圖的START( 激發時刻) 與STOP( 發光時刻) 的時間（jiān）差。由於（yú）對於Stop 信號的要求，所以TCSPC 一般需要高重複頻（pín）率的光源作為激發源，其重複至少要在100KHz 以（yǐ）上，多數的光源都會達到MHz 量級；同時，在一般情況下還要對Stop 信號做數量上（shàng）的控製，做到盡量（liàng）滿足在一個激發周期內，樣品（pǐn）產（chǎn）生且隻產生一個光（guāng）子的有效熒光信號，避免光子對的出現（xiàn）。
2 頻域測量
對連續激發光（guāng）進行振幅調製後，分子發出的熒光強度也會受到振幅（fú）調製，兩個調製信號之間存（cún）在與熒光壽命相關的相位（wèi）差，因此可以測量（liàng）該相位差計算（suàn）熒光（guāng）壽命。
左圖為正弦（xián）調製激發光（綠色）頻（pín）域顯示（shì），發射光信（xìn）號（紅色）相應的相位變化頻域顯示。
右圖為對應不同壽命的調製和相位的頻（pín）域顯示。TM- 調製壽命（mìng），TP- 相位壽命。[1]
顯微熒光壽命成像技術（FLIM）
顯微（wēi）熒光壽命成像技術（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一種在顯微尺度下展現熒光壽命空間（jiān）分布（bù）的技術（shù），由於其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術無法代替的優異（yì）性（xìng）能，目前在生（shēng）物（wù）醫學工程、光電（diàn）半導體材料等領域是一種重要的表征測量手段。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光（guāng）掃描FLIM。
寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術是用平行光照明並由物鏡聚焦樣品（pǐn）獲得熒光信號，再由一寬場相機采集熒光成像。寬場FLIM 常用於快速獲取大（dà）麵積樣（yàng）品成像。時域或是頻域壽命采集都可以應用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優勢。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針（zhēn）對選定區域內的樣品逐點獲取其（qí）熒光衰減曲線，再經過擬合*終合成熒光壽命圖像（xiàng）。相比寬（kuān）場FLIM，其在空間分辨（biàn）率、信噪（zào）比方麵有更大的（de）優勢。掃描方（fāng）式有兩種：一種是固定樣品，移動激光進行掃描（miáo），一種是固定激光，電動位移台帶動樣品（pǐn）移（yí）動進行掃描（miáo）。
FLIM 應用
材料科學領域生（shēng）命科學領（lǐng）域
OmniFluo-FLIM係列顯微熒光壽命成（chéng）像係統應用案例
1 用熒光分子對海拉細胞進行染色
用熒光分子轉子（zǐ）Bodipy-C12 對海拉細胞（宮頸（jǐng）癌細胞（bāo）的一種） 進行染色。
(a) 顯微熒光壽命成像（xiàng）圖，壽命範圍1ns（藍色（sè））到2.5ns（紅色）；
(b) 熒光壽命直方圖（tú），脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細胞中其他位置壽命較長，在1.8ns 附近。
用熒光分子轉子的時間（jiān）分辨測量*大的（de）好（hǎo）處在於熒光壽命具備足夠（gòu）清晰的標簽特性，且與熒光團的濃度無（wú）關。[2]
2 金屬修飾熒光（guāng）
金屬（shǔ）修飾熒光：
(a) 熒光（guāng）壽命是熒光團到金表麵距離的函數；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標記乳腺腺癌（ái）細胞的細胞膜的共聚焦xz 橫截麵，垂直比例尺（chǐ）：5 m；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表麵附近的（de）GFP 熒光壽命縮短。[2]
3 鈣鈦礦太陽能（néng）電池
下圖研究中，展示了一種動態熱風（DHA）製備工藝（yì）來控製（zhì）全無機（jī）PSC 的薄膜形態和穩定性，該工藝不含有常規的有害反溶劑，可（kě）以在大氣環境中製備。同時，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（zǐ）（BaI2:CsPbI2Br）。這種（zhǒng）DHA 方（fāng）法有助於形成均勻的（de）晶粒並控（kòng）製結晶（jīng），從而形成（chéng）穩定（dìng）的全無（wú）機PSC。從而（ér）在環境條件下形成完整的黑色相。經（jīng）過DHA處理的鈣鈦礦光伏（fú）器件，在0.09cm小麵積下，效率為14.85%，在1x1cm的大麵積下，具有13.78%的*高效率。DHA方法製備的器件（jiàn）在300h後仍然保持初始效率（lǜ）的92%。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍（lán）寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共焦PL mapping 圖像（xiàng）。具有較小（xiǎo）尺寸的發光團的*高密度是觀察到在GaN 上生長的MQWs。在(c) 藍寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖。僅對於在GaN 上生長的MQWs，強的PL 強（qiáng）度區域與較長PL 衰減時間的區域很好地匹配（pèi）。在(e) 藍寶石和(f)GaN 上生（shēng）長的MQWs 在A 點和B 點測量的局部（bù）PL 衰減曲線，均標（biāo）記在圖中。對於在GaN 上生（shēng）長的MQWs，點A 和B 之間的PL 衰減時間差更高。
OmniFluo-FLIM係列顯微熒光壽命成像係統參數配置
北京www.91光儀器有限公司提供的（de）顯微熒（yíng）光壽命成像係統是基於顯微和時間相關單光子（zǐ）計數技術，配合高（gāo）精度位移台得到微觀樣品（pǐn）表麵各空間分布點的熒光衰（shuāi）減曲線，再經過用數（shù）據擬合，得到樣品表麵發光壽命（mìng）表征的影像。是光電半導體材料、熒光標（biāo）記常用熒光分子等類似熒光（guāng）壽命大多分布（bù）在納秒、幾十、幾百納秒（miǎo）尺度的物質的不二（èr）選擇。
參數指標：
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係統性能指標 |
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光譜掃（sǎo）描範圍 |
200-900nm |
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*小時間分辨率（lǜ） |
16ps |
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熒光（guāng）壽命測（cè）量範圍 |
500ps-1μs@ 皮秒脈衝激（jī）光器 |
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空間分辨率 |
≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈衝激光器 |
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熒光壽命檢測IRF |
≤2ns |
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配（pèi）置參數 |
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激（jī）發源及匹配光譜範圍 （光源參數基於 50MHz 重複頻率） |
375nm 皮秒（miǎo）脈衝激光器，脈（mò）寬：30ps，平均（jun1）功率1.5mW，熒光波段：400-850nm |
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405nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：25ps，平均功（gōng）率2.5mW，熒光波段：430-920nm |
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450nm 皮秒脈衝激（jī）光器，脈寬：50ps，平均功率1.9mW，熒（yíng）光（guāng）波段：485-950nm |
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488nm 皮秒脈衝激（jī）光器，脈（mò）寬：70ps，平均功率1.3mW，熒（yíng）光波段：500-950nm |
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510nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：75ps，平均功率1.1mW，熒光波段：535-950nm |
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635nm 皮（pí）秒脈衝激光器（qì），脈寬：65ps，平均功率4.3mW，熒光波段：670-950nm |
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660nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：60ps，平均功率1.9mW，熒光波段：690-950nm |
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670nm 皮秒脈衝激光器，脈寬：40ps，平均功率0.8mW，熒光波段：700-950nm |
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科研級正置顯微鏡 |
落射明（míng）暗場鹵素燈照明，12V，100W 5 孔（kǒng）物鏡轉盤，標配明場（chǎng）用物鏡：10×，50×，100× 監視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭，像元尺寸：3.6μm*3.6μm， 有（yǒu）效像素：1280H*1024V，掃描方式：逐行，快門（mén）方式：電子快門 |
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電動位移台 |
高精度電動XY 樣品台，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， *小步進：50nm，重複定位（wèi）精度：＜ 1μm |
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光譜（pǔ）儀 |
320mm 焦距影像校正單色儀，雙入口、狹（xiá）縫出口、CCD 出口， 配置三塊68×68mm 大麵積光柵，波長準確（què）度：±0.1nm， 波長重複性：±0.01nm，掃（sǎo）描步（bù）距：0.0025nm，焦麵尺寸：30mm(w)×14mm(h)， 狹（xiá）縫縫寬：0.01-3mm 連續電動可調 |
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探測器：製冷型（xíng）紫外可見光電倍增（zēng）管，光（guāng）譜範圍：185-900nm（標配，可擴展（zhǎn）） |
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光譜CCD （可擴展PLmapping） |
低噪音科學級（jí）光譜CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測麵：30mm*3.8mm，背（bèi）照式深耗盡芯片， 低暗電流，*低製冷溫度-60℃ @25℃環境溫度，風冷，*高量子效率值（zhí）>95% |
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時間相關單光子計（jì）數器（TCSPC） |
時間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時間＜ 10ns， *高65535 個直（zhí）方圖時間窗口，瞬時飽和計數率：100Mcps，支持穩態光譜測試； |
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OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 |
控製（zhì）功能：控製樣品平移台移動，通過顯微鏡的明場光學像定位到合適區域， 框（kuàng）選掃描區域進行掃描，逐點獲得（dé）熒光衰減曲線，實時生成熒（yíng）光圖像等 數據處理功能：自動對掃描獲得的FLIM 數據，逐點進行多組分熒（yíng）光壽命（mìng）擬合 （組分數小於等於4），對逐點擬合獲得的熒光強度、熒光壽命（mìng）等信息生（shēng）成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖、色表、等高線、截線分析、3D 顯示等 |
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操作電（diàn）腦（nǎo） |
品牌操作電（diàn）腦，Windows 10 操作係統 |
FLIM 軟件（jiàn）界麵
測試軟件的界麵遵循“All In One”的簡潔設計思路，用戶（hù）可在下圖所示的控製界麵中（zhōng）完成采集數據的所有步（bù）驟：包括控製樣品平移（yí）台移動，通過（guò）顯（xiǎn）微鏡的明場光學像定位到合適區域（yù），框選（xuǎn）掃描區域進行掃描，逐點獲得熒光衰減曲線，實時生成熒光圖像（xiàng）等。
數據處理界麵
功能豐富的熒光壽命數據處理軟件，充分挖掘用戶數據中（zhōng）的寶貴信息。可自動對（duì）掃描獲得（dé）的FLIM 數據，逐點進行多組分熒光壽命擬合（組分數小於（yú）等於4），對逐（zhú）點擬合獲（huò）得的熒光強（qiáng）度（dù）、熒光壽命（mìng）等信（xìn）息生成偽彩色圖像顯示。
自主開（kāi）發的（de）一套時間相關單光子計數（TCSPC）熒光壽命的擬合算法，可（kě）對熒光衰減曲（qǔ）線（xiàn）中*多包含4 個時（shí）間組分的熒光過（guò）程進行擬合，獲得每（měi）個組分的熒光壽命，光子數比（bǐ）例，計算評（píng）價函數和殘差。TCSPC 熒光壽命通常並非簡單的指數衰減過程（chéng），而是與光源及（jí）探（tàn）測器相關的儀器響（xiǎng）應函數（IRF）與熒光衰減過程相互卷積的結果，因此適當的擬合（hé）方法和參數選擇對（duì）獲得正（zhèng）確可靠的熒光壽（shòu）命（mìng）非（fēi）常重要。該軟件可導入實際測量的（de）IRF 對（duì）衰減曲線進行卷積計算（suàn）和擬合。但是大多數情況下， IRF 很難正確的從實驗獲得，針對這種情況，軟件提供了兩種無需（xū）實驗獲取IRF 的擬合方（fāng）法：
NO.1 通（tōng）過算（suàn）法對數據上（shàng）升沿（yán）進行擬合，獲得時間響應函數IRF，然後對整條衰減曲（qǔ）線進（jìn）行卷積計算和擬合得到熒光壽命。
NO.2對於衰（shuāi）減時間遠長於儀器響應時間的，可對衰（shuāi）減曲線下降沿進行直接的（de）指數擬合。該（gāi）軟（ruǎn）件經過大量測試，可以很好的（de）滿足各種場合（hé）的用（yòng）戶需求。
MicroLED 微盤的熒光強度像（xiàng）（3D 顯示）：
13810146393
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